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丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量试剂盒说明书

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详细介绍

丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量试剂盒说明书

可见分光光度法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸,生成过氧化脂质;后者逐渐分解为一系列复杂的化合物,其中包括 MDA。通过检测 MDA 的水平即可检测脂质氧化的水平。

测定原理:

MDA 与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)缩合,生成红色产物,在 532nm有最大吸收峰,进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量;同时测定 600nm 下的吸光度,利用 532nm与 600nm 下的吸光度的差值计算 MDA 的含量。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配置:

提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;

注意事项:

临用前注意试剂一是否完全溶解,如未溶解,可以 70℃加热,并振荡以促进溶解。

MDA 提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,

加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、吸取 0.6mL试剂一于1.5mL 离心管中,再加入0.2mL 样本, 混匀。

2、95℃水浴中保温 30min(盖紧,防止水分散失),置于冰浴中冷却,10000g,25℃,离心

10min。

3、吸取上清液于1mL玻璃比色皿中,测定532nm和600nm处的吸光度,记为A532 和A600,

ΔA= A532-A600。蒸馏水调零

 

 

MDA 含量计算:

1、血清(浆)中 MDA 含量的计算:

MDA 含量(nmol/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样=25.8×ΔA

2、细菌、细胞或动物组织中 MDA 含量计算

(1)按照蛋白浓度计算

MDA 含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)=25.8×ΔA ÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2)按照样品质量计算

MDA 含量(nmol/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)

=25.8×ΔA ÷W

(3) 按照细菌或细胞密度计算:

MDA 含量(nmol/104 )=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)

=0.0516×ΔA

V 反总:反应体系总体积,8×10-4 L;ε:丙二醛摩尔消光系数,155×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.2 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

 

 

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